多肽的固相合成多肽固相合成技术

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多肽的固相合成（多肽固相合成技术）
【多肽的固相合成多肽固相合成技术】固相合成多肽的聚合物载体及连接分子
1.聚合物载体固相合成多肽需要有固相载体及连接固相与反应物的连接分子,正确选择载体和连接分子决定着固相合成法的成功。固相合成多肽用的载体多数采用聚苯乙烯及二乙烯基苯和苯乙烯共聚物等高聚物的衍生物,如氯树脂、Pam树脂、王氏树脂和氨基树脂等。载体树脂的溶胀状况对缩合试剂及羧基组分的自由扩散,对肽链之间的聚集等与缩合反应有关的因素有明显影响。为了使载体有较好的溶胀性,且有较大的网络空间足以容纳不断增长的较长的肽链,而且便于反应物进入载体的内部,一般均采用1%～2%交联度的聚苯乙烯珠状树脂或微孔树脂。
2.连接分子固相合成多肽曾经使用过键合不同连接分子的聚合物,这些连接分子为含有氯甲基、巯甲基、酰氯基、对苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物。一个理想的连接分子必须在整个合成过程中十分稳定,并在合成后可以定量的切割下来而又不破坏合成的目标分子。选择适合的连接分子还应根据与树脂相连的肽的C末端的结构类型,裂解后生成相应的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物。
固相合成多肽的检测
即使是高效的偶联技术,也不能保证酰化反应100%地进行。而且,当遇到立体障碍或Β2片层等序列时,偶联反应的效率更大大下降。聚合物载体上总是有缺序或截序的多肽链,在解脱时,它们也进入到产物中,给分离带来很大困难。因此,固相合成肽时,尤其是较长的肽时,每一个氨基酸的缩合率应该达到99.9%,否则得到的产物将非常不纯。因此,监测每一步反应的进行过程显得格外重要。（杭州专肽生物有着20余年的固相合成经验，通过固相合成技术可以满足绝大多数客户的需求）
1 定性颜色反应茚三酮显色法(Kaiser法),是用茚三酮颜色反应快速测定树脂上的氨基,从而判定酰化反应是否完全。用茚三酮法检测聚苯乙烯树脂氨基的灵敏度可达到 5μmol/g 。这样的灵敏度已可检测出缩合反应是否进行了99%以上。茚三酮检测时,由于末端氨基酸残基及序列不同, 出现的颜色强弱不同。天门冬氨酸(Asp)、天门冬酰胺(Asn)会产生很弱的蓝色或淡棕色。生色试剂2,4,62三硝基苯磺酸与树脂上氨基反应显示橙红色,灵敏度为5μmol/g树脂。
Kaiser试剂包括：
A，6%茚三酮的乙醇溶液
B，80%苯酚的乙醇溶液
C，2%0.001MKCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后，重蒸后再使用。检测过程，取少量树脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液有兰色，或树脂出现兰色，红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。还有其它检测游离氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬兰法等。
2 定量自由氨基检测水杨醛法用于接肽后树脂上残余氨基的量以及去除保护基后总氨基量的测定,可以定量地检测缩合反应以及脱除保护基的反应是否完全。如不完全即可及时反复处理。用2%水杨醛+6%吡啶的乙醇溶液同树脂上的氨基反应(60℃,30～35分钟),洗净后,再用5%苄胺乙醇溶液将水杨醛置换下来(60℃,30分钟),加苄胺的乙醇溶液稀释后,读315nm的光吸收值,计算氨基的量(Ε=4.36× 103) 。此法对于—NH2在0.15μmol/mg树脂以上的样品的相对偏差在5%以内。
3 HPLC检测部分保护的中间肽在多肽合成中间,取少量的肽树脂(3～10mg)进行裂解,乙醚沉淀,溶于适当溶剂中直接进行HPLC分析。裂解时肽的N-端保护基根据需要保留或脱除。当合成的肽是较短的极性肽时,可以保留保护基团,否则,在HPLC中保留时间太短,不利于分析。这个方法虽然比较麻烦,但所需时间较短,精确度较高。

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